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Il s'agit de la pénétration du spermatozoïde dans l'ovule.
Chronologiquement, la fécondation ne peut avoir lieu qu'au moment de l'ovulation dans le cycle féminin. C'est à dire qu'un rapport sexuel ne peut être fécondant que s'il a lieu durant les 3 à 4 jours précédents l'ovulation (ce qui correspond à la durée de vie des spermatozoïdes dans les voies génitales féminines) ou dans les 24 heures qui suivent (qui correspondent à la durée de vie de l'ovocyte).
La période de fécondabilité n'est donc que de 5 jours sur un cycle qui en compte 28.
Après l'ovulation, l'ovocyte se trouve au niveau du tiers externe de la trompe et c'est là que la fécondation peut avoir lieu. Aprés un rapport sexuel, les spermatozoïdes doivent donc remonter depuis le fond du vagin jusqu'aux trompes. Pour cela, ils doivent quitter rapidement le milieu acide du vagin qui leur est très défavorable. Dans la lumière du col de l'utérus, l'endocol, ils rencontrent la glaire cervicale. Une partie d'entre eux est maintenue en réserve dans les cryptes de l'endocol et pourront être fécondants dans les jours qui suivent. La glaire cervicale sépare les spermatozoïdes du liquide séminal. Ceux-ci remontent alors vers les trompes.
Ce trajet élimine bon nombre de spermatozoïdes. Parmi les 180 à 300 millions de spermatozoïdes contenus dans un éjaculât, seuls quelques dizaines atteignent le tiers externe de la trompe. Ceux-là ont subi la capacitation, c'est-à-dire le démasquage de leur pouvoir fécondant.
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Grace aux modifications précédent l'ovulation des cellules entourant l'ovocyte, le spermatozoïde peut facilement s'insinuer entre les cellules de la corona radiata. Certaines enzymes contenues dans l'acrosome peuvent traverser les membranes et sortir du spermatozoïde, notamment la hyaluronidase, qui facilite l'approche de l'oeuf. D'autres enzymes restent liées à la membrane interne de l'acrosome. c'est la raison pour laquelle le spermatozoïde doit subir la réaction acrosomique. Lorsqu'il arrive au contact de la zone pellucide, la membrane plasmique fusionne en de nombreux points avec la membrane externe de l'acrosome, exposant à l'extérieur les enzymes liées à la membrane interne. Parmi ces enzymes, l'acrosine permet au spermatozoïde la traversée de la membrane pellucide. Les membranes plasmiques des deux gamètes fusionnent alors et le spermatozoïde déverse tout son contenu dans l'ovocyte. Après la fécondation, la membrane pellucide est modifiée et ne permet plus l'entrée d'autres spermatozoïdes.
Seul l'ADN du gamète mâle sera utilisé, le reste de ses constituants disparaît. Le noyau mâle perd sa membrane. Le noyau de l'ovocyte termine sa division. Ils commencent alors tous deux une synthèse d'ADN tout en se rapprochant et se réunissent à l'équateur d'un fuseau mitotique rétablissant la diploïdie.
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L'oeuf maintenant formé, celui-ci va se développer.